| 指導老師 | 吳宗遠 |
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| 研究室名稱 | 基因工程研究室 |
| 研究方向 | 神經生化的基礎研究和桿狀病毒表現系統的研發是本實驗室研究的主題。在神經生化 研究的領域裡，我選擇NMDA受器（NMDA receptor）作為探討的蛋白分子，NMDA 受器在生理功能上是主導學習與記憶過程的重要分子，而在病理上也是 麩氨酸 （glutamate）產生神經毒性(neurotoxicity)引發神經細胞死亡的一個重要因子 。先前的研究中已發現NMDA受器不易以界面活性劑自突觸(synapse)中分離出而 有別於其他的受器分子，如AMPA受器和kainate受器，因此可能有一或一群特殊 之蛋白質會和NMDA受器緊密的結合，故本實驗室將先嘗試鑑定有哪些蛋白質會和 NMDA受器蛋白緊密結合，再進一步分析這些蛋白在NMDA受器所執行的生理功能與 病理過程所扮演的角色。 另一有關NMDA受器蛋白的基本問題是其合成後由內質網 再運送到細胞膜時，只有當NR1和NR2兩種次單元組合在一起才會傳送到細胞膜， 而若僅表現NR1或NR2單一次單元時，則此受器蛋白會停滯在內質網中，因此我們 將用分子生物學的技術分別建構NR1-GFP，NR1-DsRed，NR2-GFP和NR2-DsRed等方 便觀測與探討的融合蛋白來解析此問題。其中GFP，為單體型式(monomeric)可發 出綠螢光的蛋白，而DsRed則為四體型式(tetrameric)可發出紅螢光的蛋白，[但 DsRed蛋白從合成到桿狀病毒表現系統 (Baculovirus expression vector system, BEVS)之改良與應用 是本實驗室近五年的主要研究課題。 |
| 研究成果 | 在嚐試將四環黴素基因調控系統 應用在 BEVS時，發現此廣泛用於哺乳動物細胞的基因調控系統，並不適將其基本CMV啟 動子放入桿狀病毒載體中，而只能以質體型式進行昆蟲細胞表現系統之四環黴素 暫時性基因調控分析，這部分的結果已發表於Journal of Biotechnology。而進 一步的實驗分析顯示當此基本CMV啟動子，簡稱為pCm，放入桿狀病毒AcMNPV時， 此病毒之包涵體基因上游區域之序列會活化(activate) 此pCm啟動子，使其成為 一強且早期啟動的啟動子。以螢火蟲之冷光基因和水母之綠螢光基因 (GFP gene) 作為報導基因顯示pCm啟動子表現蛋白之產量可達180ug/ml，約為晚期強 啟動子p10的一半 (產量為405 ug/ml)，故是一極有利用價值的啟動子，此實驗 結果已發表於Journal of Biological Chemistry期刊。 有鑒於許多的膜蛋白或分泌性蛋白都是由兩個或兩個以上不同的次單元 所組合 而成的複合蛋白，如分泌性的抗體分子是由輕鏈和重鏈藉由雙硫鍵和非共價鍵組 合而成，而負責肌肉收縮相關的乙醯膽鹼受器 則是由α2βγδ等4種不同的次 單元組成的五位體蛋白。故欲利用桿狀病毒表現系統大量生產分泌性蛋白或膜蛋 白時，必要能於同一細胞中同時表現多種次單元蛋白，方能組合成具有功能的複 合蛋白。於哺乳動物細胞表現系統中，由於Poliovirus IRES序列的發現，可同 時表現兩種以上蛋白的bi-cistronic載體以臻成熟，於是我們分別以ECMV病毒、 C型肝炎病毒（HCV）和腸病毒（EV71）的IRES序列，測試是否能應用在桿狀病毒 表現系統中以建立可用於昆蟲系統中的IRES序列而開發出 bi-cistronic 桿狀病 毒表現系統。我們先以質體型式在COS-7細胞中分析ECMV，HCV和 EV71 等病毒的 IRES序列的活性顯示腸病毒的活性最高，可達ECMV和HCV 的10倍以上。這部分實 驗為本實驗室與國家衛生研究院徐祖安博士實驗室共同合作，部分之實驗結果已 申請美國和台灣之專利，並寫成論文送Biotechnology Bioengineering期刊送審 並進入revise階段。 生物農藥是化學農藥最佳之代替品，是解決化學農藥在農業品上殘餘的最佳辦法 ，而源自昆蟲的桿狀病毒是目前最適合基因工程開發的生物性農藥之一，因此本 實驗室也致力於開發桿狀病毒做為生物性農藥。在這方向的研究上，主要是由農 委會農糧處的支持而進行。為擴張桿狀病毒之寄主範圍，我們分析桿狀病毒 AcMNPV的IE1，P10，VP39啟動子和果蠅的hsp70啟動子，以綠螢光EGFP基因做為 報導基因，在SF21，家蠶BmN4和果蠅SL細胞株中進行分析，結果顯示AcMNPV可以 進入其非寄主細胞，而且早期啟動子IE1和hsp70皆可正常表現外源基因，但晚期 啟動子VP39和最晚期啟動子P10卻受到抑制，相關之研究結果發表於台灣昆蟲第 24卷第一期。在增益重組桿狀病毒之檢測的研究上，我們分別將綠螢光基因EGFP 和紅螢光基因DsRed置於EMCV-IRES序列的兩端，並做成重組病毒，當感染SF9細 胞時，可明顯的發出紅光和較微弱的綠光，幸運的是，在與霧峰藥毒所高穗生主 任與靳子蓉研究員實驗室進行的蟲體試驗顯示，紅螢光基因可以在日光的激發下 ，即可發出肉眼可見的紅螢光，即使是蟲體表面顏色較深的甜菜夜蛾與斜紋夜蛾 仍可輕易的以肉眼判斷是否受到病毒的感染，是項工作對於重組桿狀病毒的檢測 應用上極為重要，目前已進行本國專利的申請，並將送審申請美國之專利。由於 可以利用紅螢光簡易的判定重組病毒是否成功的感染擬尺蠖幼蟲，在農委會第三 年的支持下，我們成功的開發出突破桿狀病毒生活史的噴霧感染法，並初步證明 不含包涵體蛋白基因的芽體型或桿狀病毒可以透過氣孔感染擬尺蠖幼蟲和小夜蛾 ，但不會感染斜紋夜蛾和甜菜夜蛾幼蟲，由於擬尺蠖幼蟲可以大量集體飼育，因 此利用此桿狀病毒噴霧感染法，將可利用蟲體廉價且大量的生產桿狀病毒及重組 蛋白，此方法已獲農委會智審小組審核通過，並申請本國及美國專利中。 |
